Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất enzyme

Cấu trúc của enzym: enzym được chia làm 2 loại, một loại có cấu trúc đơn giản và một loại có cấu trúc phức tạp. Các phân tử acid amin  ở dạng L được liên kết với nhau bằng liên kết peptid. Tổng trọng lượng của protein từ 12000 đến 1000000 dalton:

• Enzym đơn giản: là loại chỉ chứa protein với khối lượng phân tử từ 100 đến 3000 acid amin.
• Enzym phức tạp: ngoài thành phần protein chúng còn chứa thành phần khác là coenzym.

Tính chất

• Có hoạt tính xúc tác mạnh, và đặc hiệu với từng loại phản ứng hoặc cơ chất.
• Trọng lượng phân tử lớn, không có khả năng tự qua màng tế bào.
• Có tính lưỡng tính, tan tốt trong nước, dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ phân cực. Lựa chọn phương pháp tách và tinh chế phù hợp.
• Kém bền và kết tụ ở nhiệt độ cao, dung dịch acid, kiềm mạnh và muối kim loại nặng.

Các ứng dụng của enzyme

Thuốc: có khoảng trên 60 loại enzyme được sử dụng làm thuốc như protease và lipase để làm sạch vết thương; trypsin, chymotrypsin, serratiopeptidase được sử dụng trong chống viêm; enzyme Hyaluronidase giúp tăng tính thấm của một số thuốc qua mô; creatine kinase được sử dụng cho bệnh nhân chấn thương và yếu cơ; sử dụng polymerase chain reaction trong chẩn đoán sớm các bệnh của thai nhi thalassemia dạng beta, thiếu máu hồng cầu lưỡi liềm, bệnh huntington; Lysozym điều trị nhiễm khuẩn; các enzym hỗ trợ tiêu hóa như amylase, pepsin, pancrease, bromelain, papain; điều trị bệnh cầu như :-asparaginase; loại các cục máu đông như streptokinase, urokinase, nattokinase…. Việc sử dụng các enzym có ưu điểm là ít gây ra các phản ứng có hại và có tính đặc hiệu cao. Tuy nhiên  chúng cũng có những nhược điểm liên quan đến các đặc tính cấu trúc, hóa lý của chúng như khối lượng phân tử lượng lớn, dẫn đến khó xâm nhập qua màng tế bào; dễ biến tính dưới tác dụng của nhiệt và pH nên việc sử dụng đường uống gặp nhiều khó khăn; kích thước lớn nên dễ bị hệ thống miễn dịch của cơ thể nhận diện và tiêu diệt; có thể gây ra hiện tượng quá mẫn khi sử dụng lặp lại; và đặc biệt là giá thành cao.

Y học: được sử chủ yếu để chẩn đoán. Như enzyme glucose oxidase trong các kit chẩn đoán tiểu đường; glutamine pyruvat transaminase trong chẩn đoán các bệnh về gan; GOT trong chẩn đoán nhồi máu cơ tim.

Công nghệ sinh học: cellulase được sử dụng trong tạo tế bào trần; polymerase được sử dụng trong công nghệ PCR.

Sản xuất các nguyên liệu làm thuốc như penicillinase- sản xuất 6 APA; sản xuất siro fructose bằng glucose isomerase.

Các phương pháp sản xuất sản xuất enzyme

Mọi cơ thể sống đều có chứa các enzym. Do đó, chúng đều được coi là nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme. Hàm lượng và khả năng tổng hợp enzyme giữa các loài là khác nhau và còn phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng phát triển, trạng thái sinh lý tế bào và các yếu tố bên ngoài khác… Nguồn nguyên liệu enzym chủ yếu từ mô và các cơ quan động vật, thực vật; tế bào vi sinh vật (công nghệ vi sinh).

Nguồn nguyên liệu từ động vật:

• Đây là cơ thể đa bào, do đó chỉ một số bộ phận nhất định được sử dụng để sản xuất các enzyme như tuyến tụy, gan, dạ dày, ruột… Các enzym chủ yếu là các protease như pepsin lấy từ dạ dày, pancreatin sản xuất từ tụy của lợn hoặc bò, trypsin được sản xuất từ dịch tụy bò; các lipase và lysozyme từ các tạng.
• Ưu điểm: enzyme có hoạt tính và độ ổn định cao.
• Nhược điểm: nguồn nguyên liệu không ổn định về hàm lượng và thành phần; không có khả năng cải tạo để tăng năng suất bằng các phương pháp đột biến; giá thành cao do thời gian sản xuất lâu, hiệu suất thấp, rủi ro về dịch bệnh thiên tai cao.

Nguồn nguyên liệu từ thực vật:

• Enzyme trong thực vật đã được sản xuất từ rất lâu đời. Các enzyme phổ biến được sử dụng là các amylase từ thóc đại mạch nảy mầm; papain từ nhựa mủ của quả đu đủ; bromelin từ mầm và lõi quả dừa; ficin từ quả sung- chất này có khả năng trị ký sinh trùng đường ruột.
• Ưu điểm: cũng có hoạt tính mạnh và ổn định như enzyme động vật; nhưng rẻ hơn nguồn động vật.
• Nhược điểm: tương tự như động vật.

Nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật: đây là phương pháp được sử dụng phổ biến. Hầu hết các enzyme từ thực vật hoặc động vật đều có thể sản xuất từ vi sinh vật như amylase, protease, pectinase, penicillin acylase…

Ưu điểm:

• Vi sinh vật phát triển và sinh trưởng nhanh thu được nhiều sinh khối, thời gian nhân lên nhanh hơn nhiều động thực vật.
• Vi sinh vật có hệ enzym đa dạng, một số loại enzyme chỉ có ở nhóm này như cellulose, nitrogenase, racemase.
• Hàm lượng enzyme chứa trong tế bào vi sinh vật rất lớn, dễ dàng sản xuất và cho hiệu suất cao.
• Các enzym này có hoạt tính cao và có độ ổn định trong khoảng nhiệt độ và pH rộng.
• Không như động vật hoặc thực vật chỉ cho một loại enzyme, vi sinh vật có thể cho tất cả các loại. Chỉ cần tích hợp gen mã hóa enzym này vào trong hệ gen vi sinh vật là chúng có khả năng sản xuất được. Có thể điều khiển khả năng sinh hoặc kìm hãm enzyme không mong muốn bằng các chất cảm ứng đặc biệt. Ví dụ như nuôi cấy vi khuẩn ASP. Niger muốn kích thích vi khuẩn sinh protease sẽ sử dụng môi trường nuôi cấy là protein; còn sinh pectinase sẽ sử dụng môi trường chứa pectin.
• Sản xuất không phụ thuộc thời tiết như với thực vật.
• Nguyên liệu nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm có thể tận dụng phế phẩm từ các ngành khác.

Phương pháp sản xuất enzyme từ vi sinh vật

Sản xuất enzyme từ vi sinh vật cũng gồm 3 bước tương tự quá trình lên men gồm trước nuôi cấy, lên men và thu sản phẩm.

Trước nuôi cấy

Chuẩn bị chủng giống: giống nuôi cấy cần phân lập đến cấp chủng. Các chủng này cần được lưu giữ tại các bảo tàng giống trên thế giới và tổng hợp enzyme muốn với năng suất cao và tinh khiết.

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

• Nguồn hydrocacbon: sử dụng các đường đơn, đường đôi như fructose, saccharose, glucose… các đường này vi sinh vật dễ tiêu hóa nên sinh trưởng nhanh để tạo các enzym; với những vi sinh vật có men amylase có thể sử dụng tinh bột hoặc các mạch đường dài như dextrin.
• Nguồn N: sử dụng nguồn Nitơ hữu cơ như bột đậu và pepton. Ngoài ra với từng loại enzym mà thêm các thành phần đặc biệt khác như pectin và lactose trong sản xuất pectinase; bã mía, mùn cưa, lõi ngô trong sản xuất cellulase;
• Chất cảm ứng: để tạo ra enzym mong muốn như amylase sử dụng tinh bột, dextrin, maltose…; proteinase sử dụng casein.
• Các thành phần khác như nguyên tố vi lượng, pH môi trường thích hợp, phá bọt… cần phải lựa chọn thích hợp.

Quá trình lên men

Điều kiện nhiệt độ, kiểm soát pH, chế độ cấp khí và thời gian nuôi cấy thích hợp để thu được sản phẩm cao và tinh khiết nhất. 2 phương pháp được sử dụng phổ biến là phương pháp lên men chìm và phương pháp lên men bề mặt.

Phương pháp lên men bề mặt:

Môi trường nuôi cấy thường bao gồm cám gạo, cám mì, bột đậu và bột ngô để cung cấp hydrocarbon và N2. Ngoài ra để tăng độ xốp, cần phải bổ sung thêm trấu và mùn cưa. Tuy nhiên nồng độ sử dụng dưới 25 %. Độ dày từ 2 đến 5 cm với độ ẩm duy trì từ 55 đến 65%, nhiệt độ từ 28 đến 30 độ C. Trước quá trình nuôi cấy cần hấp chín và làm ẩm môi trường để tiệt trùng. Thời gian nuôi cấy từ 1.5 đến 2 ngày.

Ưu điểm:

• Lên men bề mặt cho nồng độ enzyme thu được cao hơn lên men chìm (do chìm sử dụng môi trường lỏng).
• Dế sấy khô và ít làm biến đổi hoạt tính của enzyme.
• Dễ vận chuyển do ở dạng rắn.
• Thiết bị sử dụng đơn giản, dễ vận hành và ít tốn năng lượng.
• Khi bị xảy ra sự cố như nhiễm khuẩn có thể dễ dàng xử lý cục bộ.

Phương pháp lên men chìm: sử dụng môi trường nuôi cấy từ tinh bột, các nguồn nitơ hữu cơ và các chất khoáng. Cần tiến hành hấp để hồ hóa và tiệt trùng môi trường. Nuôi cấy ở nhiệt độ mát từ 28 đến 30 độ C; duy trì pH ổn định với từng loại vi sinh vật thông thường gần 7; trong quá trình nuôi cấy cần có chế độ cấp khí, khuấy trộn và làm mát thích hợp để vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất. Thời gian nuôi cấy lâu hơn bề mặt với thời gian từ 48 đến 96 giờ.

Xử lý dịch sau lên men

Có 2 dạng enzym được sử dụng là enzyme thô và enzym tinh khiết. Enzyme thô: như men sản xuất rượu và enzym tinh khiết được sử dụng trong y dược, thực phẩm hoặc các ngành công nghiệp nhẹ…

Tùy thuộc vào vị trí của enzyme là ngoại bào hay nội bào mà tiến hành phương pháp tách chiết thích hợp. Với enzyme ngoại bào, tiến hành ly tâm hoặc lọc để thu lấy dịch lọc. Còn enzyme nội bào sẽ thu sinh khối, sau đó tiến hành các biện pháp như vật lý (nghiền, nhiệt hoặc siêu âm) hóa học (acid hoặc kiềm) sinh học (sử dụng các enzym như lysozym, cellulase) để phá vỡ tế bào. Sau đó lọc lấy dịch có chứa enzym.

Chiết enzyme:

• Với enzyme thô: chỉ sấy khô đến hàm lượng từ 8 đến 12 %.
• Với Enzym tinh khiết: sử dụng kết tủa trong các dung môi hữu cơ, dung dịch muối ở nhiệt độ 28 đến 30 độ C. Sau đó cô chân không ở 10 độ C. Tiến hành ở nhiệt độ này để vẫn duy trì được hoạt tính của enzyme.

Tinh chế enzym: Enzym sau khi chiết tạo tiếp tục tinh chế bằng các phương pháp:

• Dịch chứa enzym sẽ được trộn cùng với các dung môi hữu cơ khác như ethanol, isopropanol, acetone hoặc dung dịch muối trung tính để kết tủa thu lấy enzyme (dựa vào tính chất kết tủa của enzyme bởi nhiệt, muối, dung môi).
• Do enzym có kích phân tử lớn và khác nhau, có thể tiến hành sàng phân tử để thu được enzym mong muốn.
• Tiến hành điện di để tách riêng enzyme. Do protein có khả năng tích điện nhờ nhóm amin và carboxylic.
• Sử dụng phương pháp hấp phụ hoặc sắc ký ái lực. Do có các nhóm chức đặc biệt như amin và carboxylic.
• Có thể tiến hành siêu ly tâm, các phân tử protein khối lượng cao hơn sẽ lắng xuống.